技术简介

紫外交联免疫沉淀 (crosslinking-immunprecipitation, clip) 结合高通量测序，即CLIP-Seq又称为HITS-CLIP。是一项在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用的革命性技术。
其主要原理是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生耦联，以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的RNA片段，经添加接头、RT-PCR等步骤，对这些分子进行高通量测序，再经生物信息学的分析和处理、总结，挖掘出其特定规律，从而深入揭示RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其对生命的意义。

技术优势

1） 全转录组范围内研究RNA结合蛋白和RNA相互作用网络

2） 活细胞原位研究RNA结合蛋白和RNA相互作用

3） 通过紫外交联可以加强RNA结合强度，从而可以鉴定到实际结合的短序列

技术路线

样品要求

1） 样品类型：RNA样品。

2） 样品的量：RNA量100ng以上。

3） 样品质量：RNA无明显降解，提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间，浓度≥ 500 ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥ 7。

4） 样品保存：RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

5） 样品运输：样品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰运输。

数据分析

应用案例

Nat Struct Mol Biol. 2012 Nov;19(11):1124-31.

CLIP-seq of eIF4AIII reveals transcriptome-wide mapping of the human exon junction complex.

Saulière J, Murigneux V, Wang Z, Marquenet E, Barbosa I, Le Tonquèze O, Audic Y, Paillard L, Roest Crollius H, Le Hir H.

外显子连接复合物（EJC）是mRNA过程的核心影响因子，把核苷酸过程与mRNA的转录、翻译和监控联系在一起。然而，对于它的转录组靶标我们知之甚少。我们用紫外交联免疫沉淀的方法结合高通量测序（CLIP-seq）在人的细胞中识别DEAD-box解旋酶eIF4AIII的结合位点和一个EJC的核心复合物。CLIP序列形成的峰主要分布在剪切mRNAs上。大多数表达的外显子峰位于典型的EJC区域，或是外显子连接处上游24个核苷酸上，或是在其他非典型区域。这些类型的峰尤其会先与非结构化且包含GAAGA模式富含嘌呤的序列相关，这是与EJC先关因子的潜在蛋白结合位点。因此，EJC的位置在外显子之间进行空间和质量上的变化。这一映射到人eIF4AIII基因的转录组揭示出EJC意想不到的一面，同时扩大其在转录后调控的潜在影响。

Figure 2. eIF4AIII与mRNA外显子的主要联系. (a)CLIP-seq映射到6个人类基因组的区域（5′ UTR, 编码序列, 3′ UTR, 内含子, 非编码RNA 或基因间区）的序列百分比. (b) 在6个区域中，每个序列在基因组的丰度分布图.  (c) CLIP-seq 映射到ncRNA组: （lincRNA, miRNA, rRNA, snoRNA , snRNA, tRNA 或者其他的非编码RNA ）的序列百分比.

Figure 4. eIF4AIII 在体内标志着特定的外显子连接区域.

参考文献

[1] KönigJ, Zamack K, Luscombe NM,et al. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspecives .Nat Rev Genet.  2012 Jan 18;13(2):77-83.

[2] Brazão TF, Demmers J, van IJcken W, et al.A new function of ROD1 in nonsense-mediated mRNA decay.  FEBS Lett. 2012 Apr 24;586(8):1101-10.

[3] Murigneux V, Saulière J, Roest Crollius H, et al.Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. 2013 Mar 30. pii: S1046-2023(13)00091-1.

[4] Saulière J, Murigneux V, Wang Z, et al.CLIP-seq of eIF4AIII reveals transcriptome-wide mapping of the human exon junction complex. Nat Struct Mol Biol. 2012 Nov;19(11):1124-31.