|
DIA定量蛋白质组
一、DIA定量蛋白质组简介及实验分组设计
DIA定量技术，即将整个质谱扫描质量范围分为若干窗口，依次对每个窗口的所有离子进行碎裂，采集全部子离子信息。该技术无需指定目标肽段，扫描点数均匀，利用谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选，同时可实现数据回溯。
二、DIA定量蛋白质组技术优势
●高通量与高深度： （保证实在的机时，充分挖掘蛋白信息）
根据样品复杂程度，建库机时保证在12-18h,一次实验可检测到4000种以上蛋白并定量。
●特异性好、灵敏度高：
DIA技术继承了MRM的数据采集模式，结合高分辨率的Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪，具有与MRM相当的灵敏度， 定量准确度几乎与MRM技术相当，基于质谱的蛋白质组学精确到单个氨基酸位点，蛋白鉴定非常准确，重复样品间的定量相关性可达到0.99以上，是profiling分析和PTM研究的强大工具。
●严格的质量控制：
数据稳定、重现性好，定量范围可跨越4个数量级，不依赖搜库鉴定极大得降低实验假阳性假阴性。
●专业的数据分析：
专业的统计和生信分析，出版级的图表展示，完整全面的分析报告。
三、实验流程
四、分析流程
1、建库及DIA定量流程
2、DIA定量蛋白质组学生物信息分析基本流程
五、应用领域
●大规模寻找差异表达蛋白
●适合于10个以上样品的非标定量比较研究
●生物标志物筛选
●疾病标志物筛选
●药物作用靶点研究
●特殊功能蛋白质筛选
●分子机制研究
六、仪器平台
Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪（本领域顶尖质谱仪，官方链接：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/IQLAAEGAAPFADBMBCX?SID=srch-srp-IQLAAEGAAPFADBMBCX ）。
The Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪使科学家能够分析更具挑战性的低丰度、高复杂性样品，并能更快地识别更多化合物，同时定量更准确，结构解析更透彻。
绝佳的性能
1、超高分辨率，高达 500,000 FWHM，可消除干扰；
2、母离子选择使用四极杆质量过滤器，使离子阱和 Orbitrap 质量分析器可以并行操作，以获得出色的灵敏度和选择性；
3、多重解离技术——CID、HCD 和可选 ETD——配有离子阱或 Orbitrap 检测可以在任何 MSn 级别进行检测，最大程度提高其在研究应用中的灵活性；
4、碎片的灵活性——CID-HCD、HCD-CID 和 HCD-HCD——在 MSn 分析的任何阶段与任一质量分析器检测的碎片离子一起，可以对代谢物、多糖和其他小分子进行详细的结构测定；
5、带轴向场的主动离子束传输组件可以降低噪声并增加耐用性；
6、新型 Orbitrap 分析仪设计和双压离子阱配置可以提供快速 MS/MS 扫描，扫描率高达 20 Hz，具有无与伦比的谱图质量；Thermo Scientific™ Easy-Max NG™ 与可选的 Thermo Scientific™ Ion Max NG™ 及 Nanospray Flex NG™ 离子源均为具有下一代性能的离子源。
|
样品类型 |
样品要求 |
|
蛋白提取物 |
蛋白总量≥500µg，浓度≥1µg/µl；IP类蛋白总量≥10µg，浓度≥0.25µg/µl |
|
细胞样品 |
细胞量≥3-5×106 细胞沉淀体积约30-50µl |
|
组织样品 |
新鲜动物组织干重≥100mg；植物湿重≥1g；微生物≥200mg |
|
体液样品 |
全血≥5ml；血清/血浆≥500µl；尿液≥50ml唾液、羊水、脑脊液等体液≥5ml |
八、参考文献
1.Ting, L.; Rad, R.; Gygi, S. P.; Haas, W., MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature methods 2011, 8 (11), 937-40.
2. Gillet, L. C.; Navarro, P.; Tate, S.; Rost, H.; Selevsek, N.; Reiter, L.; Bonner, R.; Aebersold, R., Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Molecular & cellular proteomics : MCP 2012, 11 (6), O111 016717.
3. Rost, H. L.; Rosenberger, G.; Navarro, P.; Gillet, L.; Miladinovic, S. M.; Schubert, O. T.; Wolski, W.; Collins, B. C.; Malmstrom, J.; Malmstrom, L.; Aebersold, R., OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data. Nature biotechnology 2014, 32 (3), 219-23.
4. Tsou, C. C.; Avtonomov, D.; Larsen, B.; Tucholska, M.; Choi, H.; Gingras, A. C.; Nesvizhskii, A. I., DIA-Umpire: comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nature methods 2015, 12 (3), 258-64, 7 p following 264.
5. Collins, B. C.; Hunter, C. L.; Liu, Y.; Schilling, B.; Rosenberger, G.; Bader, S. L.; Chan, D. W.; Gibson, B. W.; Gingras, A. C.; Held, J. M.; Hirayama-Kurogi, M.; Hou, G.; Krisp, C.; Larsen, B.; Lin, L.; Liu, S.; Molloy, M. P.; Moritz, R. L.; Ohtsuki, S.; Schlapbach, R.; Selevsek, N.; Thomas, S. N.; Tzeng, S. C.; Zhang, H.; Aebersold, R., Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nat Commun 2017, 8 (1), 291.
6. Chapman, J. D.; Goodlett, D. R.; Masselon, C. D., Multiplexed and data-independent tandem mass spectrometry for global proteome profiling. Mass Spectrom Rev 2014, 33 (6), 452-70.
7. Selevsek, N.; Chang, C. Y.; Gillet, L. C.; Navarro, P.; Bernhardt, O. M.; Reiter, L.; Cheng, L. Y.; Vitek, O.; Aebersold, R., Reproducible and consistent quantification of the Saccharomyces cerevisiae proteome by SWATH-mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics : MCP 2015, 14 (3), 739-49.
8. Vowinckel, J.; Zelezniak, A.; Bruderer, R.; Mulleder, M.; Reiter, L.; Ralser, M., Cost-effective generation of precise label-free quantitative proteomes in high-throughput by microLC and data-independent acquisition. Scientific reports 2018, 8 (1), 4346.
9. Vidova, V.; Spacil, Z., A review on mass spectrometry-based quantitative proteomics: Targeted and data independent acquisition. Anal Chim Acta 2017, 964, 7-23.
10.Malmstrom, E.; Kilsgard, O.; Hauri, S.; Smeds, E.; Herwald, H.; Malmstrom, L.; Malmstrom, J., Large-scale inference of protein tissue origin in gram-positive sepsis plasma using quantitative targeted proteomics. Nat Commun 2016, 7, 10261.
11. Ghodasara, P.; Sadowski, P.; Satake, N.; Kopp, S.; Mills, P. C., Clinical veterinary proteomics: Techniques and approaches to decipher the animal plasma proteome. Vet J 2017, 230, 6-12.
