导读：
核膜从空间上分离转录和翻译，因此核质运输是真核细胞中蛋白质合成的关键。然而，这一过程背后的机制在植物中仍是未知的。
在这项研究中，作者分离了一个玉米突变体 (ddk1)，该突变体表现出种子发育延迟和灌浆缓慢。Ddk1编码一种称为Importin-4 β的植物特异性蛋白，其突变导致80S单体减少和蛋白质合成抑制。研究发现DDK1在体内与eIF1A蛋白相互作用。然而，体外实验显示，在没有RanGTP的情况下，这种相互作用表现出低亲和力。野生型的eIF1A蛋白主要定位于细胞质中，但在ddk1突变体的细胞核中仍保留了大量的eIF1A蛋白。
这些观察结果表明，DDK1作为一种输出蛋白，与RanGTP协同促进eIF1A的核输出，从而在翻译水平上调节胚乳发育。重要的是，DDK1和eIF1A在不同的植物物种中都是保守的，这意味着这个调控模块在不同的植物中都是保守的。
文章索引
标题：Maize DDK1 encoding an Importin-4 β protein is essential for seed development and grain filling by mediating nuclear exporting of eIF1A.
发表期刊：New Phytologist
发表时间：2023.12
作者团队：中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿研究组、齐鲁师范学院玉米分子育种研究院路小铎研究组
IF：9.4
DOI：10.1111/nph.19475.
研究思路：
研究结果：
（1）突变体ddk1表现出延迟发育表型
ddk1突变体在种子发育和籽粒灌浆方面表现出明显的延迟。ddk1种子尺寸更小，种冠凹陷更大，看起来更不透明(图1a-d)。测量结果显示，与WT W64A相比，ddk1的籽粒长度、宽度、厚度和百粒重均显著降低(图1e)。ddk1种子总蛋白含量显著高于W64A，而淀粉含量没有变化(图1e)。
进一步，作者发现了ddk1胚乳发育发育明显延迟（图1f），胚乳中淀粉颗粒(SGs)和蛋白体(PBs)的填充也明显减慢（图1g-h）。
综上所述，这些结果表明，ddk1突变导致植株和种子发育延迟，籽粒灌浆速度减慢。
（2）Ddk1编码一种Importin-4 β蛋白
作者发现Ddk1编码植物特异的Importin-4 β蛋白，在突变体中该基因上包含一个SNP，该SNP并没有影响mRNA表达水平，但导致蛋白质氨基酸序列的改变（G292D），从而能影响了蛋白质的稳定性，导致在ddk1中不能检测到DDK1G929D的积累。
（3）Ddk1的系统发育及表达模式分析
作者基于DDK1及其同源蛋白的全长蛋白序列构建了系统发育树。系统发育树显示，DDK1在单子叶和双子叶植物中具有保守性(图3a)。
RT-qPCR检测了Ddk1在发育中的籽粒中的表达模式，发现Ddk1转录本在授粉后不同天数的籽粒均有表达，但在10 DAP之前水平更高(图3b)。免疫印迹分析显示，DDK1在早期和填充期具有相似的蛋白水平(图3c)，这表明DDK1可能在转录和翻译水平上受到调节。
亚细胞定位实验中，在细胞核和细胞质中检测到DDK1-GFP的荧光信号(图3d,e)。相比之下，表达ddk1-GFP时，细胞中未检测到GFP信号(图3f,g)。这些结果表明，DDK1中的第929位的甘氨酸(G)对其蛋白质稳定性至关重要。
（4）Ddk1突变导致核糖体生物发生相关基因表达上调
Ddk1突变对玉米胚乳发育过程中全局基因表达的影响是什么？
作者对Ddk1-1和WT W64A 4-DAP籽粒以及12-、16-DAP胚乳进行了RNA- seq分析。
在上述三个不同阶段共鉴定出334个差异基因，包括237个上调基因和97个下调基因(图4a)。GO分析显示，上调基因主要富集在核糖体结构成分、翻译过程、多肽生物合成过程、细胞周期过程和DNA复制过程(图4b)。
在这些差异基因中，共检测到47个核糖体相关基因，其中46个显著上调，只有一个下调(图4c-d)。
因此，Ddk1突变后导致籽粒发育延迟却诱导大量核糖体编码基因显著上调表达，这可能是由于ddk1蛋白质的合成速率降低的一种正反馈调节。
（5）ddk1-1胚乳中蛋白质合成被抑制
ddk1-1中的蛋白质合成是否受到抑制呢？
作者采用多聚核糖体（Polysome profiling）分析来检测WT和ddk1-1胚乳在16 DAP时全局的翻译变化。
结果发现，ddk1-1胚乳中40S和60S核糖体亚基以及多聚体只有轻微改变，但与WT胚乳相比，80S单体的水平显著降低，表明ddk1-1发生了显著的翻译变化(图4e)。
SUnSET实验进一步比较了全局蛋白质合成的速度。结果显示：与WT原生质体相比，ddk1-1原生质体的蛋白质合成总体下降(图4f)。这些结果表明，Ddk1突变导致蛋白合成受到抑制。
另外，尽管16-DAP ddk1-1胚乳中玉米蛋白基因的转录水平均显著升高(图4g)，但三个主要玉米蛋白亚群(27-kDa γ-zein, 22-kDa和19-kDa α-zeins)的积累明显减少(图4h)，表明玉米蛋白的合成在ddk1-1胚乳中受到抑制。
（6）DDK1介导eIF1A家族蛋白的核输出
DDK1如何在翻译水平上调控玉米籽粒发育？
研究表明：IMP-β蛋白可以直接结合GTP结合形式的小G蛋白Ran (RanGTP) 。LCI分析表明，DDK1在体内与所有四种Ran蛋白相互作用(图5a,b)。GST pull-down实验表明：DDK1与RanGTP (Q72L)具有很强的结合亲和力(图5c)。这些结果证实了DDK1在体内和体外均与RanGTP相互作用。
通过酵母双杂交文库筛选获得DDK1的潜在底物（图5d），阳性克隆中有80%的基因都编码eIF1A。
首先，通过LCI分析(图5e)和Co-IP实验(图5f)证实了DDK1在体内与eIF1A-1具有很强的相互作用。
其次，体外GST pull-down实验发现DDK1不能单独结合eIF1A-1。但当RanGTP (Q72L)加入到反应中，DDK1对eIF1A-1则表现出很强的亲和力(图5g)。因此推测DDK1作为一种输出蛋白，与RanGTP合作，结合细胞核中的eIF1A家族蛋白并将其转运到细胞质中。
免疫荧光分析发现，在野生型中eIF1A主要积累在细胞质，而在ddk1中eIF1A大量积累在细胞核(图5h-i)。说明DDK1充当Exportin来介导eIF1A出核转运。进一步在胚乳中特异的敲低eIF1A后，会导致胚乳的灌浆缺陷（图5j-l），说明eIF1A能够在翻译水平上调控玉米籽粒的发育。
研究结论：
该研究首次克隆并报到了核转运蛋白能够参与调控玉米籽粒的发育，同时阐明了DDK1/eIF1A模块作用机制，为未来分子设计育种提供了潜在靶标。由于DDK1和eIF1A在不同植物中都非常保守，因此该作用机制在不同植物中是保守的。
