导读
研究表明，间充质干细胞(MSC)衰老与机体衰老及骨关节炎(OA)等衰老相关疾病的发生密切相关。m6A是一种常见的RNA修饰，在调节细胞生物学功能中起重要作用，而ALKBH5是关键的m6A去甲基化酶之一。然而，m6A和ALKBH5在MSC衰老中的作用尚不清楚。
本研究发现，在多次扩增、H2O2刺激或紫外线照射诱导的衰老MSCs中，m6A水平升高，ALKBH5表达降低。ALKBH5表达下调后，可通过增强CYP1B1 mRNA的稳定性和诱导线粒体功能障碍促进MSC衰老。此外，IGF2BP1被鉴定为CYP1B1 mRNA的m6A-Reader。此外，敲除MSCs中的ALKBH5可加重小鼠自发性OA，过表达ALKBH5可提高MSCs在OA中的效果。
总的来说，本研究揭示了m6A在MSC衰老中的新机制，并确定了抗衰老和OA的可能靶点。
文章索引
标题：ALKBH5 facilitates CYP1B1 mRNA degradation via m6A demethylation to alleviate MSC senescence and osteoarthritis progression.
发表期刊：Experimental And Molecular Medicine.
发表时间：2023.08
作者团队：中山大学附属第八医院沈慧勇教授团队
IF：12.8
DOI：10.1038/s12276-023-01059-0.
研究思路
研究结果
（1）在MSC衰老过程中，m6A修饰水平升高，ALKBH5水平降低
为了确定m6A修饰是否参与MSC衰老，作者首先采用多次扩增、H2O2刺激和紫外线辐射分别诱导MSC衰老。SA-β-gal阳性细胞比例增加(图1a, d, g)，细胞周期阻滞相关蛋白p53, p21和p16的表达随着扩增代数的增加或H2O2或UV处理的增加而增强(图1b, e, h)，表明成功诱导MSC衰老。
m6A点印迹分析结果显示：在所有三种模型中，m6A修饰的丰度都显著增加(图1c、f、i)。此外，检测了不同代细胞中m6A修饰的关键因子的表达。结果显示，随着细胞代数的增加，METTL3和ALKBH5的表达水平下降，而其他基因没有明显变化(图1j, k)。
总之，这些发现表明m6A可能在MSC衰老中起作用，而ALKBH5可能是关键因素。
（2）ALKBH5缺乏促进MSC衰老
为了评估METTL3和ALKBH5对MSC衰老的影响，作者在MSC中分别做了siRNA敲降（图2a, b）。结果显示，ALKBH5的敲降可增加MSCs中SA-β-gal阳性细胞的数量，导致p53、p21和p16水平显著升高，并有助于MSCs阻断在G0/G1期，而METTL3的敲降则没有显著影响(图2c-f)。
此外，还检测了DNA损伤的标志物p-H2A.X的荧光信号。结果表明ALKBH5的敲低增强了p-H2AX信号(图2g)。
总之，这些结果表明ALKBH5缺乏促进MSC衰老。
（3）ALKBH5通过m6A去甲基化活性延缓MSC衰老
为了进一步确定ALKBH5在MSC衰老中的功能，作者使用慢病毒系统上调了ALKBH5的表达(图3a, c)。ALKBH5 WT过表达降低了SA-β-gal染色强度、β-gal活性、p53、p21和p16的表达以及MSCs中G0/G1期细胞的百分比(图3b- d)。
同时，过表达了缺乏m6A去甲基化活性的ALKBH5突变体 (H204A)，结果显示ALKBH5突变体没有产生显著影响。此外，WT ALKBH5而非MUT ALKBH5有助于缓解H2O2刺激(图3e-g)或UV辐射(图3h-j)诱导的MSC衰老。
综上所述，这些结果表明ALKBH5通过其m6A去甲基化活性减轻MSC衰老。
（4）CYP1B1是ALKBH5调控衰老的下游靶点
为了进一步探讨ALKBH5在MSC衰老中的作用机制，作者结合MeRIP-Seq和RNA-Seq检测了ALKBH5敲低的MSCs中m6A修饰谱和基因表达谱。
结果显示：在MSCs中m6A主要发生在转录本的3'UTR(40.56%)和5'UTR (28.66%)(图4a)；鉴定出m6A甲基化的一致序列基序“RRACH”(图4b)；并对m6A修饰与基因表达进行联合分析(图4c)。随着ALKBH5基因的敲低，更多的基因获得了更强的m6A修饰。因此，作者从中筛选除了几个参与细胞周期或细胞衰老基因。
检测发现敲低ALKBH5会提高CYP1B1的mRNA和蛋白水平(图4d, e)，但对其他基因没有明显影响。此外，MeRIP-qPCR分析证实，干扰ALKBH5会增强CYP1B1的m6A修饰(图4f-g)。最后结合RIP实验和RNA pull down的结果揭示了CYP1B1通过m6A修饰成为ALKBH5的下游靶点。
接着，作者就进一步确定CYP1B1对MSC衰老的影响。CYP1B1敲低可降低MSCs中p53、p21、p16的表达，降低SA-β-gal阳性细胞比例、β-gal活性和G0/G1期细胞比例，逆转ALKBH5表达下调对MSC衰老的影响(图4h-j)。此外，通过慢病毒过表达CYP1B1，发现CYP1B1显著促进MSC衰老(图4k-m)。这些发现表明CYP1B1是ALKBH5的下游基因，参与调控MSC衰老。
（5）ALKBH5-CYP1B1通过线粒体功能障碍调控MSC衰老
CYP1B1主要位于线粒体，可能参与线粒体功能障碍和ROS产生，这是导致细胞衰老的关键原因。
作者检测了CYP1B1对MSCs线粒体功能和ROS生成的影响。结果显示，过表达CYP1B1或ALKBH5敲降均显著提高了MSCs中总ROS水平(图5a)。这种影响通过敲除CYP1B1成功消除(图5b)。
随后，通过检测线粒体膜电位(MMP)、ATP生成和线粒体ROS来评估线粒体的功能。结果显示，CYP1B1表达上调会损害MMP(图5c、d)和ATP的产生(图5e)，但会增加MSCs中线粒体ROS信号传导(图5f)。
作者对此还做了ALKBH5敲低和CYP1B1沉默的验证(图5c-e, g)。综上所述，这些结果表明ALKBH5和CYP1B1通过调节线粒体功能障碍和ROS产生来调节MSC衰老。
（6）ALKBH5敲低后以依赖IGF2BP1的方式增强CYP1B1 mRNA的稳定性
作者进一步探讨了ALKBH5如何通过m6A修饰介导CYP1B1的表达。作者结合网站预测上和MeRIP-Seq数据，选择了CYP1B1上7个高置信度的m6A位点，构建了具有相应点突变的过表达CYP1B1 CDS的质粒(图6a)。然后，敲降ALKBH5后并将WT或MUT CYP1B1质粒转染到MSCs中，发现在MUT4组中CYP1B1的表达没有明显变化(图6b)，这表明CYP1B1 mRNA上的m6A位点4是ALKBH5介导的关键位点。
那ALKBH5调控的m6A修饰对CYP1B1 mRNA的影响是什么？
报道表明，m6A修饰通常调控mRNA的稳定性、翻译效率、细胞易位或剪接。因此，作者逐一进行了研究：
Ø ALKBH5敲低不影响CYP1B1剪接(图6c)。
Ø ALKBH5敲低不影响CYP1B1 mRNA的核和细胞质比例(图6d)。
Ø Polysome profiling分析显示ALKBH5敲低并不会改变Polysome上CYP1B1 mRNA的丰度，表明ALKBH5不会调节CYP1B1的翻译效率(图6e)。
Ø 敲低ALKBH5显著增强了CYP1B1 mRNA的稳定性(图6f)。
这些发现表明，ALKBH5通过破坏CYP1B1 mRNA的稳定性来降低CYP1B1的表达。
那调节CYP1B1的m6A“Reader”是谁？
IGF2BP1/2/3被报道可以增强转录的稳定性。因此，作者下调了IGF2BP1/2/3在MSCs中的表达，发现IGF2BP1而不是IGF2BP2或IGF2BP3在mRNA和蛋白水平上增加了CYP1B1(图6g-j)。
二者的互作通过RNApull-down和RIP实验得到了验证(图6k)。此外，发现IGF2BP1的敲低加速了CYP1B1 mRNA的降解速率(图6l)。
总之，上述数据表明IGF2BP1是CYP1B1 mRNA上的m6A“Reader”，这有助于提高其稳定性。
（7）条件ALKBH5敲除小鼠表现为严重OA, ALKBH5提高了MSCs对ACLT诱导的OA的疗效
最后，作者评估了ALKBH5和CYP1B1在衰老和OA中的作用。结合衰老小鼠模型和MSCs中特异性敲除ALKBH5的转基因小鼠模型，敲除MSCs中的Alkbh5促进了OA的发展，而Alklbh5的过表达增强了MSCs治疗OA的功效。
研究结论
该研究首次揭示了ALKBH5通过m6A修饰CYP1B1调控MSC衰老，为治疗年龄相关疾病和提高MSC疗效提供了有希望的靶点。
文章中Polysome profiling分析由新开源（晶锐）协助完成
