是时候给宝子们比较一下翻译组学技术了~~

翻译控制比转录控制更快、更灵敏，极大地提高了基因表达调控的灵活性和复杂性，使生物能够在各种应激条件下生存。翻译组学使我们能够在全局范围内直接研究最重要的步骤。它带来了理论上的突破，并在医学和工程领域带来了新的应用。

2019年1月，暨南大学张弓教授团队在International journal of molecular sciences上发表了题为“Translatomics: The Global View of Translation”的综述文章。文章总结了翻译组学的主要技术方法，给要做翻译调控研究的宝子们提供了很好的理论支持。

翻译调控是细胞内最重要的调控方式。因此，有必要在全球范围内研究翻译。翻译组学研究翻译过程中所有成分，包括但不限于翻译mRNA、核糖体、tRNA、调节性RNA和新生多肽链。近年来的技术进步在全局范围内对这些成分的研究带来了突破，包括它们的组成和动态。这些方法已在越来越多的研究中得到应用，以揭示翻译控制的多方面。翻译过程不仅限于将 mRNA 编码序列转化为多肽链，它还以一种精妙而敏感的方式控制蛋白质组的组成。因此，翻译组学已将其独特和创新的力量扩展到许多领域，包括蛋白质组学、癌症研究、细菌应激反应、生物节律性和植物生物学。

研究正在翻译mRNA的方法

mRNA为蛋白质合成提供了蓝图。研究翻译mRNA是翻译组学的首要任务。由于核糖体与mRNA非共价结合，因此核糖体新生链复合物 (RNC) 非常脆弱，在细胞裂解后易于解离或降解。目前开发了几种重要且经典的方法来分析翻译mRNA的不同特征：多聚核糖体图谱分析（polysome profiling）、全长翻译mRNA分析 (RNC-seq)、翻译核糖体亲和纯化 (TRAP-seq) 和核糖体分析 (Ribo-seq)。这些方法的基本原理下图所示。

多聚核糖体图谱分析（polysome profiling）

20世纪60年代，基于蔗糖梯度超离心发展了polysome profiling。核糖体是大多数细胞中最大的大分子复合物。与更多核糖体结合的mRNA分子在蔗糖梯度下沉积更快。因此，在蔗糖密度梯度离心后，游离的RNA和蛋白质由于密度的关系浮在蔗糖密度梯度的顶部。从底部缓慢泵入蔗糖溶液，可以分离出与不同数量核糖体结合的mRNA。然后用northern blot, microarray或RT-PCR分析组分中的mRNA，以反映转录本翻译的分布。该技术通常用于检测翻译中的大变化。例如，在高渗透压下，单个核糖体的组成显著增加，在氧化应激下，与单个mRNA结合的核糖体数量显著增加。

需要注意的是，研究人员通常认为主动翻译的mRNA结合多个核糖体。然而，最近的研究表明，那些结合单个核糖体的mRNA的翻译是活跃的。例如，在HEK293细胞和指数生长的大肠杆菌(E. coli)中，被认为在翻译中非常活跃的单体部分(原核生物为70S，真核生物为80S)占主导地位。当单体部分被分离并转移到无细胞翻译系统时，核糖体可以恢复翻译并产生蛋白质。在酿酒酵母中，单体是延伸的，而不是起始的。短开放阅读框(ORF)、快速翻译基因和低丰度mRNA在单体部分中富集。这些结果证明翻译活性与结合在mRNA上的核糖体的数量不成正比。

全长翻译mRNA分析 (RNC-seq)

将细胞裂解物加载到30%蔗糖溶液上，并进行超速离心以将所有与核糖体相关的翻译 mRNA从游离mRNA和其他细胞成分中分离出来。超速离心使RNCs沉淀。RNC-mRNA可以很容易地从颗粒状的RNC中回收，有效地避免了高浓度蔗糖对下游研究的干扰。RNC-mRNA的二代测序揭示了翻译mRNA的全长信息，包括丰度和类型。通过优化离心和蔗糖缓冲，RNC回收率可以达到 90%，并且在适当缓冲液中，RNC仍保留翻译活性。RNC-seq的技术难点在于完整RNC的分离。RNC的脆弱性导致核糖体解离和mRNA断裂/降解，从而导致对RNC-mRNA的分析有偏差。

核糖体分析 (Ribo-seq)

用低浓度的核糖核酸酶 (RNase) 处理细胞裂解物以降解mRNA，但受核糖体保护的RNA片段除外。然后，通过下一代测序 (NGS) 分析22-35nt mRNA片段（核糖体足迹，RFP），相当于核糖体保护片段（RPF），以揭示核糖体的位置和密度。根据位置信息、每个转录本上核糖体的分布和密度，可以推断出诸如起始密码子位置（包括非ATG起始）、密码子使用偏差、上游ORF (uORF) 和翻译暂停。这些方面无法通过其他翻译方法进行研究。2016 年，开发了一种优化的Ribo-seq方法--超分辨率核糖体分析，能够观察单个转录本中全局3nt周期性。这种方法提高了Ribo-seq发现小ORF (sORF) 和未注释的新编码区域的能力，这些区域可能编码来自注释的非编码RNA和假基因的蛋白质。核糖体分析中核糖核酸酶T1是最好保持核糖体的完整性的酶。Ribo-seq另一版本是翻译复杂轮廓测序 (TCP-seq)。用甲醛用于交联快速冷却的酵母细胞，使其mRNA翻译复合物在其天然位置停滞，然后进行RNase消化后，使用蔗糖梯度超速离心分离完整的核糖体和小亚基 (SSU)，然后对这些片段上长达250nt的RNA片段进行测序，以分别在翻译的起始、延伸和终止阶段得到自然分布图谱。该方法能够沿mRNA的5'非翻译区(UTR)观察SSU足迹，并在所有翻译阶段捕获任何类型的核糖体-mRNA复合物的位置。

首先，Ribo-seq 需要大量细胞作为起始材料。其次，许多其他因素会影响RFP的数量，例如伪RPF。由于Ribo-seq主要分析核糖体与mRNA结合的编码序列 (CDS)，与翻译调控高度相关的非翻译区 (UTR) 无法有效分析。此外，Ribo-seq 经常会生成许多映射到非编码RNA的“RFP”，这表明存在相当大的假阳性率。

另外，RFP长度短（原核生物为24~26nt，真核生物为28~30 nt），受核糖体大小的限制，无法进一步延伸。为了获得中等丰度mRNA的足够覆盖率，需要扩大测序通量（通常每个样本> 1亿次读取），这意味着测序和计算成本会很高。即便如此，许多翻译事件，尤其是剪接变体和环状RNA的剪接点仍然难以涵盖。因此，更长的读取长度是适用的。更长的reads几乎可以完全覆盖大多数翻译mRNA，包括低丰度的mRNA。

值得强调的是，RFP的密度并不代表翻译活动。RFP密度与翻译起始速率成正比，与伸长速度成反比。如果翻译在某个mRNA上完全停滞，RFP将在该mRNA中高度富集，但翻译活性为零。

翻译核糖体亲和纯化 (TRAP-seq)

在组织特异性启动子和融合亲和标签（如多组氨酸、绿色荧光蛋白（GFP）等）控制下产生的大核糖体亚基蛋白Rpl25p。这些核糖体随后被亲和纯化，与其他细胞类型的核糖体分离。TRAP-seq 可从难以分离样本分理出RNC-mRNA，并且通过TRAP-seq分离的核糖体不会被可能与核糖体共沉淀的非核糖体mRNP污染，因为TRAP-seq不使用超速离心。TRAP-seq在复杂组织中具有特殊优势，可从特定细胞类型中分离翻译mRNA。然而，TRAP-seq需要稳定转染的细胞系来产生标记的核糖体蛋白。当应用于植物和动物时，构建稳定的转基因生物是不可避免的。这是耗时、昂贵且不适用于尚未建立稳定转化方法的物种。此外，标记核糖体蛋白有可能改变这些核糖体的结构和特性。因此，系统不再处于生理条件下。

不说了，上表！！

参考文献：
Zhao J, Qin B, Nikolay R, Spahn CMT, Zhang G. Translatomics: The Global View of Translation. Int J Mol Sci. 2019 Jan 8;20(1):212. doi: 10.3390/ijms20010212. PMID: 30626072; PMCID: PMC6337585.